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锡麟与马宗汉、陈伯平各捐得官职，并被获准前往日本学习陆军。但到日本后，由于清廷驻日公使的阻挠，学习陆军的计划被破坏，无奈回国。
归国后，徐锡麟等人又打算进一步打入官府，“藉权倾虏廷“。通过发动利用各方关系，徐锡麟谋得筹办安庆陆军小学之事。后因表叔俞廉三的推荐和徐锡麟本人的精明干练，终于得到安徽巡抚恩铭重用，1906年冬季他到了安庆，向抚院落报到，恩铭接见后，派他为安徽巡警尹。他小心逢迎，拜恩铭为师，恩铭引为亲信，又派他兼任巡警学堂会办。徐锡麟食清廷之禄，却时刻不改革命之志。
光绪三十三年(1907年)2月，徐锡麟与秋瑾约定在皖、浙同时举行反清武装起义。起义原定7月19日举行，因一会党人员在上海被捕，招供出革命党人的一些别名暗号，两江总督端方电令恩铭拿办。恩铭召徐锡麟计议，徐锡麟见自己别号在列，知事机迫人，遂决定于7月8日巡警学堂举行毕业典礼时举义。谁知恩铭这天有事，要求将毕业典礼提前两天，无奈起义只得于6日举行。外援不至，准备未周，起义堪忧。
1907年7月6日，光复会成员安徽巡警处会办兼巡警学堂监督徐锡麟，在安庆刺杀安徽巡抚恩铭，率领学生军起义，攻占军械所，激战4小时，失败被捕，慷慨就义。审讯时挥笔直书:“蓄志排满已十余年矣，今日始达目的。本拟杀恩铭后，再杀端方、铁良、良弼，为汉人复仇。“
1907年7月7日，徐锡麟被清廷杀于安庆抚院门前，心肝被挖，用于炒菜，时年35岁。
1903年，徐锡麟从日本回到绍兴后，认识到革命应该从创办学堂、培育人才入手，随即在家乡东浦创办了一所新式学堂，并为学堂写了一副对联:有热心者可与共学，具诚意者得入斯堂。取上下联各一字，命名为“热诚学堂“。除文化课外，专门增设兵式体操课，进行军事训练。他在授课时，经常介绍时事政治，宣传革命，激发学生爱国热情。后来热诚学堂一度成为绍兴光复会的活动基地。
1904年，徐锡麟接受蔡元培的邀请加入了光复会。当时浙江各地的会党十分活跃，在反清统治和“仇洋灭教“的斗争中显示了巨大力量。但这些会党各自为政，互不统属。如何把分散的会党组织、联络起来，引导到光复会组织中来，实现民主革命的大联合，这是摆在光复会面前的重要课题。徐锡麟亲自带领几名学生到各地会晤会党首领。历时两月，徒步寻访了嵊县、诸暨、东阳、金华、缙云等各地会党，结识了竺绍康、王金发等会党首领，联络进步人士，发展会员，扩大了组织，使光复会成为浙江反清革命的领导核心。
1904年底，徐锡麟在与各地会党联络中发现，虽然会党众多，也有一定势力，但明显素质偏低，要想联合各派并发挥作用，必须加以培训和教导。因此，萌生了创办一所“武备学校“以培训会党骨干的想法。1905年，徐锡麟说服富商许仲卿出资，创办大通学堂，并邀请秋瑾来主持。绍兴文史专家林文彪认为，大通学堂的创立，是辛亥革命史甚至是整个中国革命史上一个十分耀眼的闪光点，它的历史贡献可以与后来的黄浦军校相媲美。而在徐锡麟等人的努力下，大通学堂成了当时的革命指挥中枢，徐锡麟也成了光复会的实际领袖之一。
1907年，光复会员徐锡麟.秋瑾领导了震惊中外的浙皖起义。起义虽然失败了但是影响是巨大的，原因是它一方面刺杀的是清廷封疆大吏，位及巡抚的恩铭。一方面是它发动的地点在安庆，绍兴，这些地区都是清王朝的重地。这次起义沉重的打击了清朝统治，加速了立宪的进程，激励革命党人的斗志，探索起义的新途径。